IVT在mRNA生产中的重要性

IVT（体外转录）是mRNA生产工艺中至关重要的步骤。一个高效的IVT体系不仅可以提升产量、减少材料使用和降低生产成本，还能够保证mRNA的完整性、加帽率和双链RNA杂质的控制等关键质量指标，从而降低后续纯化工艺的难度，起到关键的承上启下作用。

IVT反应的基本组成

IVT反应的整体过程相对简单，标准的IVT体系主要包括DNA模板、T7RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂和反应缓冲液等成分。DNA模板通常为PCR产物或线性化质粒，包含T7启动子、5’UTR、编码区（CDS）、3’UTR和Poly（A）尾等元件；NTPs作为mRNA的底物，可以通过替换为修饰核苷酸来提升mRNA的稳定性和免疫原性；辅助成分如无机焦磷酸酶可水解转录过程中产生的焦磷酸，提高反应效率，而RNase抑制剂则防止可能存在的RNase污染。T7RNAP则是整个反应体系的核心酶，负责识别DNA模板并进行转录。

T7RNAP对IVT的影响

T7RNA聚合酶在IVT体系中扮演着重要的角色。它通过识别T7启动子序列，结合到DNA模板上并催化RNA的合成。与其他RNA聚合酶相比，T7RNAP具有高特异性，不需要额外的辅助因子即可完成转录，这使其成为体外转录mRNA的重要选择。

根据研究，温度对saRNA的完整性有显著影响，随着温度升高，saRNA的产量虽然增加，但在超过某一阈值后，完整性会急剧下降。这为优化saRNA的完整性提供了新的研究方向。

鸿运国际通过荧光激活液滴分选技术（FADS）结合酶定向进化平台，选择性筛选出了多种T7RNA聚合酶突变体。这一技术能够高效地处理微液滴，提高了筛选的通量和可视化效果，有助于获得更高效、耐高温的T7RNAP突变体，为后续mRNA合成提供了新的选择。

反应缓冲液对IVT体系的影响

高性能的酶并不足以保证反应的成功，优化反应缓冲液同样是至关重要的。IVT缓冲液通常需要包含多种成分，如盐类、pH缓冲剂和二价阳离子等，这些成分的浓度和比例直接影响RNA聚合酶的活性及RNA的质量和功能。研究表明，pH值和镁离子浓度对IVT反应的影响尤其显著，最优范围通常位于中性或略偏碱性。

此外，鸿运国际在缓冲体系的研究中发现，不同类型的阴离子，如醋酸根离子在提高转录产量方面表现优于氯离子。这些发现为后续的反应优化提供了重要参考。

添加剂的作用

近期的研究表明，特定突变体T7RNAP能够降低Cap1的投料量，从而在共转录体系中显著降低成本。鸿运国际的研究还表明，通过实时监测方法，可以快速评估转录效率，这一方法兼具简便性和快速性，有助于在不同研究中实现高效的mRNA合成。

总结与展望

对于以mRNA为基础的疫苗和药物开发而言，关键质量属性的控制至关重要。鸿运国际持续优化上游原材料，提升反应性能，提供一站式体外转录解决方案。我们期待通过推出系列专题文章，分享更多mRNA合成相关的技术及经验，与广大研究人员和客户探讨合作的机会。