鸿运国际人高转移性肝癌细胞MHCC97H/LUC培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人高转移性肝癌细胞MHCC97H/LUC

生长特性：贴壁生长

冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM+10%FBS+1%P

传代方法：第一次建议使用1:2的比例进行传代

备注：在传代后的2天内换液，用无菌离心管收集培养基，以便进行过渡对比培养。如果对比效果不理想，建议直接购买鸿运国际的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，培养至良好状态，灌满完全培养液并封好瓶口是最佳的运输方式。接收细胞时，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后隔离至超净台内，严格遵循无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，然后进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片（最好是40x、100x和200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片则默认收到状态良好。传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以进行对比培养，并在换液后松开瓶盖。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

若细胞未超过80%汇合度，将瓶中完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5%CO2孵箱培养；若超过80%密度则进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞大部分变圆并脱落，快速返回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶，观察细胞状态，待细胞皱缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清后，将细胞沉淀与1ml鸿运国际无血清冻存液（货号：C7001）混匀，倒入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如后期需要转入液氮管中，需在-80℃冰箱保存24小时以上后再转入液氮管。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直至管中无结晶，再用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，重悬细胞于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，放在37℃、5%CO2培养箱中。
4. 第二天，用新鲜的完全培养基进行继续培养。

四、注意事项

某些细胞在贴壁时不牢固，运输过程中可能发生细胞脱落，属正常现象。如脱离较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清用于过渡培养。沉淀后添加1-2ml胰酶，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清，加1-2ml完全培养基重悬。之后按1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

若细胞出现问题，以下情况可重发：1）细胞在运输过程中遇到的各种问题，包括丢失、瓶身破损、培养液漏液等；2）收货后48小时内提出细胞污染问题，需提供真实实验结果审核；3）常温发货细胞静置24小时后，干冰发货细胞复苏24小时后，若大多数细胞未存活，需提供真实清晰的细胞状态照片；4）干冰发货细胞复苏后24小时或常温发货细胞静置4小时，且未开封出现污染，均可重发；5）细胞活性问题，请在收货7天内提供真实的实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，审核后可重发；6）收货当天以及第2、3天拍照记录，未告知的视为合格；若在4-7天内出现问题，并提供前3天的照片及详细操作步骤，经过技术人员审核后若判定责任归属，则可重发；否则按合同价的50%进行重发处理。

在以下情况下不予重发：1）客户造成的细胞污染；2）不当操作致使细胞状态不佳；3）采用非推荐培养体系的细胞状态不佳；4）未提供细胞培养前3天照片的情况；5）培养时经其他处理的；6）收到后2天内未通知；7）视具体情况而定。