细胞凋亡是一种常见的程序性细胞死亡方式，伴随着明显的细胞形态学变化。例如，在凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转至细胞膜表面。而在凋亡的中后期，随着细胞膜通透性增加，一些较大的分子，例如碘化丙啶（PI），可以自由穿透细胞，将细胞核染成红色荧光。

Annexin V/PI 检测法原理

Annexin V是一种依赖钙离子的磷脂结合蛋白，能够特异性地高亲和力结合PS。值得注意的是，Annexin V无法透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜仍然完好，因此对PI具有拒染性。然而，在凋亡中晚期的细胞及死细胞中，PI能够穿透细胞膜并使细胞核染色。因此，通过同时使用Annexin V和PI，可以有效区分早期的凋亡细胞与其他细胞。

鸿运国际建议的Annexin V/PI凋亡检测步骤

[名称] 流式凋亡检测试剂盒 [货号] AC12L033 [规格] 100T

1. 对照管设置

1. 空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用于电压调节；

2. 单染管：分别准备PI和荧光标记的Annexin V两个单染管，用于补偿调整；

3. 实验管：诱导凋亡的细胞加所有实验所需的荧光染料；

4. 阴性管：在正常培养细胞中加入染料，以确认细胞处于正常状态并排除假阳性。

2. 悬浮细胞染色步骤

1. 完成细胞凋亡刺激后，离心5分钟，弃去上清，收集细胞，并使用PBS轻轻重悬细胞并计数；

2. 取1~5×10^5重悬的细胞，离心5分钟，弃去上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞；

3. 添加5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5µl碘化丙啶，轻轻混匀；

4. 室温避光孵育10分钟，可使用铝箔进行避光；

5. 立即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

3. 贴壁细胞染色步骤

1. 吸出细胞培养液至合适的离心管，使用PBS洗涤贴壁细胞一次，随后使用胰酶消化液消化细胞；

2. 细胞消化后，执行与悬浮细胞相同的操作步骤。

4. 上机检测

染色孵育后，立即进行流式细胞仪或荧光显微镜检测。

Annexin V/PI检测注意事项

• 在检测贴壁细胞时，若不好控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，以避免对细胞造成损伤，并保持细胞膜上PS的分布。
• 选择Annexin V的荧光染料时需考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间较久或经过药物处理的细胞，要注意细胞代谢物及药物本身的荧光干扰。建议使用Annexin V-APC，对于药物干扰，可查看药物的发射光谱。
• 细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测，应可将检测管放在冰上，以减少外界环境对结果的影响。
• 在进行凋亡统计时，通常统计早期凋亡细胞，因为只有早期凋亡才具有一定的生物学意义，当然也有文献提及总的凋亡比例（早期与晚期之和），单纯统计晚期凋亡的意义不大。

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