1. 目的细胞根据标准细胞培养方案在血清培养基中进行培养。

2. 在检测前一天，使用无血清培养基（0.2%BSA）处理细胞。

3. 在无血清培养基中过夜培养后，吸出细胞培养基并使用PBS进行冲洗。

4. 向细胞添加胰蛋白酶溶液，以启动细胞分离过程。

5. 将细胞悬液转移至试管中，进行350×g离心5分钟。

6. 将细胞重新悬浮在预热的细胞培养基中。

7. 将细胞悬液稀释至100,000个细胞/ml的接种密度。

细胞接种与培养

1. 向接收板的每个孔中加入200μl含或不含化学引诱剂的培养基（在此情况下，不同浓度的FCS从0.25%到10%不等）。

2. 将制备好的细胞悬液以50μl的量加入膜板的每个孔中。

3. 将细胞培养板置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24小时。

细胞培养基的更换与荧光检测

1. 从接收板的各孔中吸出细胞培养基。

2. 向每个接收孔中加入150μl无血清培养基，并添加8μM（在DMSO中稀释）的钙黄绿素AM。

3. 在37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养45分钟。

4. 吸出膜板和接收板的各孔中的细胞培养基。

5. 用PBS分别冲洗两块板的孔。

6. 向接收板中加入胰蛋白酶溶液，使膜下侧迁移的细胞开始脱离。

7. 胰蛋白酶溶液孵育10分钟，并轻轻摇动。

8. 将每孔180μl的胰蛋白酶细胞悬浮液转移至黑色96孔微孔板的每个孔中。

9. 在激发波长为485nm、发射波长为520nm的读板器中进行荧光读取。

膜检查与细胞迁移监测

1. 吸出膜板各孔中的培养基。

2. 使用预湿的棉签，顺时针和逆时针轻轻旋转棉签，以去除膜上未迁移的细胞。

3. 使用绿色通道中的荧光显微镜检测膜下侧迁移细胞的荧光信号。此外，ThinCert® 96孔HTS小室由于其独特的孔结构提供了高透明度，促进活细胞观察，用于检查细胞形态、评估细胞融合，并以更高的准确性和可靠性进行污染监测。因此，每次实验均伴随对细胞的连续显微镜监测。

在肿瘤转移、血管生成和炎症性疾病等复杂生物医学现象的研究中，体外细胞迁移实验是不可或缺的工具。它们提供了一个可控环境，以测量细胞迁移及分析不同分子的影响，如生长因子和趋化因子，或候选药物。特别是孔径的精确选择对迁移实验至关重要，孔径需与所研究细胞的尺寸成比例，既具有足够的限制性以防止细胞被动移动，又具有足够的允许性以促进其主动迁移。

借助鸿运国际的相关技术与设备，您可以优化实验过程，提升细胞迁移实验的效率，为寻找更好的生物标志物、治疗靶点和药物开创新的可能。